一、方法
1、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法
陽離子脂質(zhì)體表面帶正電荷,能與核酸的磷酸根通過靜電作用,將DNA分子包裹入內(nèi),形成DNA脂復(fù)合物,也能被表面帶負(fù)電的細(xì)胞膜吸附,再通過融合或細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中,是目前實驗室方便的轉(zhuǎn)染方法之一,其轉(zhuǎn)染率較高,優(yōu)于磷酸鈣法。由于脂質(zhì)體對細(xì)胞有一定的毒性,所以轉(zhuǎn)染時間一般不超過24小時。常用細(xì)胞類型:cos-7 、BHK、NIH3T3 、Hela等。
2、電穿孔轉(zhuǎn)染法
電流能夠可逆地?fù)舸┘?xì)胞膜形成瞬時的水通路或膜上小孔促使DNA分子進(jìn)入胞內(nèi),這種方法就是電穿孔。當(dāng)遇到某些脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率很低或幾乎無法轉(zhuǎn)入時建議用電穿孔法轉(zhuǎn)染。一般情況下,高電場強(qiáng)度會殺死50%-70% 的細(xì)胞?,F(xiàn)在針對細(xì)胞死亡開發(fā)出了一種電轉(zhuǎn)保護(hù)劑,可以大大的降低細(xì)胞的死亡率,同時提高電穿孔轉(zhuǎn)染效率。
3、病毒感染
對于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染與電穿孔轉(zhuǎn)染都無法成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系建議用病毒感染,此法可以快速100%感染,檢測成功率高。
二、常用步驟
1. 轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備
① 將400ul去核酸酶水加入管中,震蕩10秒鐘,溶解脂狀物。
② 震蕩后將試劑放在-20攝氏度保存,使用前還需震蕩。
2. 選擇合適的混合比例(1:1-1:2/脂質(zhì)體 體積:DNA質(zhì)量)來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA,震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑,再次震蕩。
3. 將混合液在室溫放置10―15分鐘。
4. 吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基,用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。
5. 加入混合液,將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時。
6. 到時后,根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液,之后加入*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時。
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